利用台式自动微流控分液仪
减小RNA测序时的反应体系
AutomationandMiniaturizationofLow-InputRNA-SeqSamplePrepUsingDesktopMicrofluidics
作者：JeremyLambert1,TommyDuong2,PaulScott1,MagnoliaBostick2,AndrewFarmer2
1Formulatrix,Inc.,Bedford,MA2ClontechLaboratories,MountainView,CA
Abstract/摘要
NGS的发展让科学家们更快捷/系统地研究基因组差异化，转录调控及疾病早期诊断等机制及应用。NGS配套试剂种类繁多，往往价格不菲，如SMART-Seq试剂盒，用户每年产生上百万元的试剂消耗。如何在不损失实验数据的前提下节约试剂用量，成了绝大多数科学家们关心的话题。
本文涉及的应用，利用Formulatrix公司的Mantis纳升分液仪，成功地将RNA-seq的反转录体系和建库体系均缩小至1/4（12.8ul和12.5ul），极大地节约试剂消耗量。文章同时进行了标准反应体系和缩小反应体系的数据对比，结果显示在两种体系下，反转录的cDNA片段大小及分布和测序比对数据具有一致性可比性，缩小反应体系完全可以替代标准反应体系进行RNA测序。因此，科学家们完全可以利用纳升分液仪缩小测序反应体系，用同样的试剂进行4倍以上样品量的测序。
正文
RNA测序工作流程中，缩小反应体积/减少试剂用量可以使研究人员在总试剂用量不变的情况下，对更多的样本进行检测。但越小反应体系，添加试剂的精确性对实验的质量和重复性越重要。
本文中，我们将使用一款紧凑型自动微流控分液仪，缩小RNA测序反应体积，并对缩小体积前后的实验结果进行详细比较分析。实验中使用了Clonetech的SMART-Seq?v4Ultra?LowInputRNA试剂盒和IlluminaNexteraXT试剂盒。
材料和方法
SMART-Seqv4UltraLowInputRNA试剂盒
SMART试剂盒实验中(图1)，当第一条cDNA链合成到mRNA模板5’端时，基于MMLV的反转录酶会向cDNA的3’端添加非模板核苷酸(-XXXXX)。模板更换时，特制的SMART寡核苷酸引物会与第一条cDNA3’端的非模板核苷酸配对。此时，第二条cDNA单链会以第一条cDNA为模板进行复制，完成双链cDNA的合成。在合成过程中，SMART技术确保5’端mRNA序列不丢失；同时也便于在cDNA的两端添加特定序列，用于全长cDNA的快速扩增。
图1.SMARTtechnologyforcDNAsynthesis
Mantis微量自动分液仪
Mantis(图2)是一款编程简单、微量加样、低死体积和非接触式的自动分液仪。该仪器可实现最多48种试剂的自动分液，每孔分液范围为0.1纳升-2毫升，最高兼容孔板。
当Mantis使用移液器枪头分液时，试剂会直接注入微流控芯片，实现低至6微升的死体积。该特点非常适用于NGS样品制备过程中的分液实验，节约宝贵的样品和试剂。
cDNA合成和文库制备
实验采用SMART-Seqv4UltraLowInputRNA试剂盒，对10ng小鼠脑组织总RNA和个K细胞进行标准反应体积和缩小反应体积的对比实验，以及相应的阴性对照。具体反应体积见Table1。cDNA扩增使用8次PCR循环。经过8个PCR循环扩增所得的PCR产物，将通过片段分析仪(AATI)和PicoGreen分别进行定性和定量分析。
表1：cDNA合成试剂用量-完整用量和缩小化后用量对比。
使用NexteraXT试剂盒，对pg的cDNA产物建库。标准反应体系和缩小反应体系各试剂构成见Table2。实验时，仅使用缩小反应体积对四个阳性样本cDNA产物(10ng脑组织标准反应体积缩小反应体积，个细胞标准反应体积缩小反应体积)进行建库。建库时使用12次PCR循环。
此外，我们还对不同数量的细胞，用缩小反应体积进行cDNA合成和建库实验。实验用细胞为，，10和1个，cDNA合成时PCR分别采用8，11，14和17次循环。
表2：NexteraXT片段文库制备试剂用量对比表
测序和数据分析
将编码标记的样品混合后，用MiSeq2*75bp读长测序。在CLCGenomicsWorkbench对reads进行处理，并比对到rRNA和线粒体基因组上。随后，将第一步未比对上的reads，通过RefSeq掩蔽，比对到人基因组(hg19)和小鼠基因组(mm10)上。由此生成独特的比对reads及对应百分比，包括外显子、内含子和基因间区域。每个文库中的基因按RPKM≥0.1的标准鉴定。比对RefSeq后，各基因的表达水平通过CLCGenomicsWorkbench获得。
实验结果
cDNA合成
图3：电泳图显示标准反应体积和缩小反应体积的
cDNA产物片段大小分布情况相同
表3.说明PicoGreen方法测定的两种体系中cDNA产量水平相当。
图4:细胞和脑组织两种样本在标准反应体积和缩小反应体积时，扩增建库后的cDNA大小分布情况相同
测序结果-标准反应体积和缩小反应体积对比
表4:两种反应体积的RNA测序数据分析结果具有一致性
测序结果-梯度细胞数量缩小反应体积
表5.通过Pico-Green实验测量cDNA产量(ng/?μl)
表6：缩小反应体后，不同细胞数量的RNA测序结果具有一致性
结论:
使用SMART-Seqv4UltraLowInputRNA试剂盒进行cDNA合成及建库测序，标准反应体积和缩小反应体积的两个实验结果具有一致性/可比性：
两种反应体积反转录的cDNA片段大小和平均产量接近类似
两种反应体积的RNA测序数据分析结果相同类似
因此，RNA测序流程中，完全可以借助Mantis纳升分液仪缩小反应体积，节约试剂用量或扩大测序样本数。在其它类似的PCR/NGS/单细胞等实验应用中，Mantis同样可以类似原理提高科研人员利用试剂的效率，在相同不增加经费情况下检测并得到更多样本数据。
波士顿富默乐科技
联系我们：
波士顿富默乐科技
上海牡丹路60号室
邮件：info
formulatrix.
联系电话：